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Biosens Bioelectron:利用免疫磁性试纸条高灵敏度定量检测血液

发布时间:2019-12-18 06:45 来源:未知 编辑:admin

  图1.检测示意图。在图1中,抗原(antigen)是待测蛋白(如PSA),MP是磁性纳米颗粒,颠倒放置的Y是特异性结合待测蛋白的抗体。检测抗体(蓝色的Ys)捕获待测蛋白,控制抗体(黄色的Ys)捕获与磁性纳米颗粒偶联的抗体。图片来自这项研究的作者。

  这种新开发的测试系统类似于早孕测试。利用由多孔材料制成的含有一条测试线(test line)和控制线(control line)的小型试纸条就可进行分析。一滴液体样品加在试纸条的一端上,在较短时间后,分析结果可根据控制线或测试线和控制线的显色反应而呈现出来。这些试纸条在使用前可长时间储存着。这种测试快速进行,也不需要由经过专业训练的人员来执行;测试可在病人旁边或者甚至在户外条件下轻松完成。

  在分子水平上,这种磁性纳米颗粒与特异性结合到靶蛋白的抗体偶联在一起,然后将它们放置在事先确定好的试纸条加样位点附近的多孔纤维素膜上。这种液体样品在毛细管作用下沿着这种纤维素膜侧向扩散,并捕获磁性纳米颗粒。它接着遇见测试线和控制线。测试线含有能够捕获靶蛋白的检测抗体(test antibody),通过双抗夹心方法,这种检测抗体也能捕获与靶蛋白抗体偶联的磁性纳米颗粒。如图2所示。控制线含有控制抗体(control antibody),该控制抗体仅捕获与磁性纳米颗粒偶联的抗体,只要测试条可以使用,那么控制线在任何情况下都会发生显色反应。因此,控制线可用来指示这项测试是否可靠、它的蛋白抗体是否因储存错误而被破坏,以及测试液体是否正确地加入到试纸条中。

  在样品浸润试纸条以及抗体彼此发生反应之后,就能够读取测试结果。这确实类似于早孕测试中的步骤。在经典的早孕测试中,测试结果是“Yes”或“No”。然而,针对这种新的测试方法而言,研究人员不仅能够高灵敏地检测蛋白,而且能够确定这种蛋白的浓度。测定这种浓度的准确性甚至超过了专业人员仅在实验室条件下才能进行的测试方法的准确性。

  论文通信作者Alexey Orlov说,“在正常情况下,利用荧光或颜色标志物,测试不仅能够在实验室条件下执行,也能够在户外条件下开展,检测结果可通过目测或者摄像机加以确定。就我们的这项研究而言,我们使用磁性颗粒,其显著优势在于:即便试纸条上滴入完全不透明的液体(如全血样品),它们也能被用来确定全血样品中的物质。利用一种可携带的设备可完全通过电子学方法进行准确地定量测定。这完全排除了任何不明确的地方。”

  研究人员注意到,除了高灵敏地检测蛋白浓度外,这种新的测试系统的动态测量范围更广:测试浓度上限是下限的4000多倍。

  这种新的测试系统可被用来测量血液中的最低浓度为0.025ng/ml的前列腺特异性抗原(PSA)。PSA是临床男性筛查中最常用的检测标志物之一。健康的PSA浓度低于4ng/ml。

  PSA是前列腺癌的潜在标志物之一,而且它在法医学上也被用来检测精液痕迹。这两项应用具有一些局限性,它们不能够决定性地诊断或证实嫌疑人的罪行,但是这种新的传感器检测平台将不只是分析PSA;之所以选择这种特殊的蛋白进行研究是为了证实这种方法的确可行。

  测定PSA的灵敏度要足以确定前列腺移除后是否会复发,以及所获得的结果应当有助于开发潜在的疗法。它不仅能够判断一种特定的标志物是否超出正常范围,而且也能够用来轻松地追踪疾病中蛋白标志物浓度的动态变化。

  为了验证这种新方法的测试结果,研究人员利用了作为金标准方法的酶联免疫吸附法(ELISA)进行测量,并进行比较,结果证实这种新的测试系统工作非常良好,而且比传统方法更有显著优势。

  在这项新的测试系统中,研究人员利用他们自己的专利方法---磁性颗粒定量(magnetic particle quantification, MPQ)---先进行非线性磁化,然后准确地对磁性纳米颗粒进行计数。利用这种方法,研究人员能够记录最低至60×10-21摩尔的磁性纳米颗粒,并且线万倍。在此之前,还从没有在这种水平上记录到这些参数。这种方法涉及给磁性纳米颗粒施加两种频率交替变化的磁场,并监控在组合频率下的感应反应。

  很多分析物质的方法是基于测试对象(不论是颗粒还是分子)受到电磁场的影响。在适当的频率下,样品开始积极地吸收辐射,或者作为响应,发出辐射。在这项研究中,研究人员使用磁场的两种频率组合,并监控这两种频率线性组合所产生的频率---也被称作组合频率(combinatorial frequency)---下的反应。

  MIPT纳米生物技术实验室主管Maxim Nikitin说,“我们之前在美国芝加哥大学研究人员的一个合作项目中已证实这种检测磁性颗粒方法的高灵敏度。我们使用我们的传感器在动物体内记录基于同位素59Fe的放射性磁性纳米颗粒(参见发表在Journal of Applied Physics期刊上的标题为“Quantitative real-time in vivo detection of magnetic nanoparticles by their nonlinear magnetization”的论文,doi: 10.1063/1.2830947)。特别地,我们也已发现这种电子方法的检测阈值与伴随的γ射线辐射的报道阈值相一致,这意味着在许多生物物理研究中,磁性纳米颗粒能够替换放射性标志物。在当前的研究中,我们使用这种方法实现免疫检测时的超高灵敏度。”从医生角度来看,磁性纳米颗粒明显更好地用于诊断研究,因为这可防止病人遭受过量放射性辐射。

  GPI RAS实验室主管和研发负责人Petr Nikitin博士(1979年从MIPT毕业)说,“所开发的磁性方法和对试纸条上的纳米标志物(即与抗体偶联的磁性纳米颗粒)进行计数的记录仪不仅提供抗原浓度测量的检测极限和范围,而且它们也能够有效地控制检测过程的全部阶段:从免疫检测程序的开发和优化,到执行免疫检测和判读检测结果。特别地,这是通过定量监控生化反应期间纳米标志物沿着试纸条的三维多孔纤维素膜(如前面提及的多孔纤维素膜)的再分布而实现的。再者,用来合成这些磁性纳米颗粒的铁盐相对而言更容易获得,也比用来合成金纳米颗粒的试剂更加便宜,其中金纳米颗粒常用于诸如早孕测试之类的阈值测试中。”

  这种新方法的可靠性、易获得性、高准确性和高灵敏度意味着它可能从实验室原型快速转变为可以大规模产生的产品。这种方法的开发者迄今为止还给出具体的时间表,但是他们强调他们的测试系统不仅可用来诊断疾病,而且也能够用于许多其他方面的应用。这种测试系统能够分析食品产品和药物;它也能够用于环境监控。它能够在现场自行完成全部检测过程,而且也不需要任何复杂或昂贵的设备。(生物谷

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